Western blot及CoIP实验步骤

Western-Blot&Co-iP

步骤：

（一）提蛋白

1.       弃细胞培养基，用1x PBS（建议经过过滤）清洗两次；

2.       将细胞培养皿放在冰上，加入含有抑制剂的裂解液（RIPA Buffer），4˚C冰箱中裂解20min~30min。

3.       收集裂解液在一个新的1.5ml EP管中，在4˚C下以15000rpm离心15min~30min；

(二)WB

4.       取出适量的蛋白样品（上清），加入loading buffer（将6x的loading配比成1x，即5体积的蛋白裂解液+1体积的6x loading buffer），95˚C（或100˚C）金属浴5min。

a)                      上清收集离心后，可直接冻存在-20˚。等到要上样的时候，加入loading buffer。进行蛋白变性。

b)                      6x loading buffer从冰箱中取出后需要先进行预热至液体不再黏稠（可以在金属浴旋转放置20sec）。

5.       金属浴结束后，样本短暂置于冰上冷却后。用小型离心机离心，将液体管壁上的液体集中在管底；

6.       用1x running buffer进行电泳（一个孔最大上样量是20µl）；

a)                      金斯瑞的预制胶底部有封条，需要使用前撕开。美伦的胶需要先在室温静置5～10min。拔梳子要在液体环境下均匀用力缓慢拔出，确保没有胶残留在孔里面；

b)                      电泳电压不宜过快，如若过快会导致蛋白样本模糊以及有拖带；

c)                      上样量不能过多，否则蛋白条带会不够锐利。（推荐量10µl）；

d)                      上样时尽量将样品在加在电泳胶的正中间，空白孔使用等量的1xloading填上；

e)                      确保样品之间的盐浓度是平衡的，确保蛋白泳道不会歪。

7.       转膜(湿转)

黑胶白膜：注意不要有气泡，用转膜液，110v，100min，置于冰上。黑板对黑面，白板对红面。

a)                      在转膜液中安装好三明治（黑板-黑网-滤纸-胶-膜-滤纸-黑网-白板），这样可以排除气泡。

b)                      湿转的电泳槽埋在冰下以后，加入约1/4的脸盆的水。确保电泳槽被冰水混合物接触。

c)                      装膜前可选操作是：将蛋白胶在转膜液浸泡5～10min洗去电泳液。

d)                      转膜液可回收，但必须经过过滤，除去液体中的固态残留物。避免影响下次实验。

8.       封闭：用含有5%的牛奶或者2～5%的BSA in 1x TBST中封闭，室温摇床1h～1.5h；

a)                      部分抗体对封闭的液体是有要求的。注意先看抗体说明书。如果是磷酸化Tyr的抗体绝对不能使用脱脂牛奶封闭。

b)                      封闭液中含有蛋白，所以现配现用。

c)                      在荧光蛋白质印迹实验中，Tris 盐缓冲液 (TBS) 用作封闭缓冲液稀释剂。封闭缓冲液中不得有 Tween 20® 去垢剂，因为它能自发荧光并增加非特异性背景。封闭步骤后，随后的稀释剂缓冲液再添加 Tween20® 。化学发光蛋白质印迹实验在封闭期间无需省去 Tween 20®。

d)                      封闭结束可以用1XTBST清洗有粘性的牛奶封闭液

9.       一抗孵育：4˚C下摇床过夜孵育，或在室温下摇床孵育2小时；

a)                      部分抗体含有HRP的基团可以直接省略后续的步骤10和11。

10.       清洗1：室温下用1x TBST清洗三次，每次5min；

11.       二抗孵育：在室温下摇床孵育2小时；

12.       清洗2：室温下用1x TBST清洗三次，每次5min；

13.       显影：显影液1:1配制，（室温避光放置5h没问题）

溶液配制：

1.       NaCl (MW: 58.44)

4M 50ml 11.688g

2.       Tris [tris base] (MW: 121.14)

1M 50ml 6.057g

3.       NP40裂解液：

Tris 50mM 

NaCl 200mM

NP40 1%

4.       裂解液(现配现用）：

RIPA或者np-40(store)：1ml

磷酸酶抑制剂A：10ul

磷酸酶抑制剂B：10ul

蛋白酶抑制剂P：10ul

5.       1x电泳液（现配现用，美伦有自己的10x buffer，一次电泳大约需要800ml）：

金斯瑞：为配制好的粉末融于1L的蒸馏水中

美伦生物：使用10x的液体，稀释到1L的蒸馏水中

6.       10x转膜液配方（常温保存）：

Tris                ：30.3g

甘氨酸        ：151.1g

蒸馏水        ：up to 1L

7.       1x 转膜液（可重复使用，4度保存，必须每次过滤，溶液变绿后丢弃）：

8.       10x TBS：

注意：可能需要15ml的浓盐酸调节pH值。浓盐酸1：3稀释在dH2O中，注意浓盐酸稀释会释放大量的热量，且对乳胶手套有一定的腐蚀性。在通风橱中小心操作。

9.       1x TBST：

10.       抗体配制：

配制一抗，1:1000，可以回收利用，保存于-20冰箱。（一抗有专门的一抗稀释液，也可以用含有5% BSA或5%牛奶的TBST稀释，也可以TBST 直接稀释）

二抗配制为1:2000，可以回收利用，保存在-20°。（可以用含有5% BSA或5%牛奶的TBST稀释，也可以TBST 直接稀释）